• 分類：科研成果
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• 來源：深圳先進院
• 發布時間：2025-05-23 10:33
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【概要描述】新月柄桿菌（Caulobacter crescentus）憑借其獨特的不對稱分裂特性，在細胞分化、極性分裂以及細胞周期相關分子調控機制的研究領域占據重要地位，被視為研究單細胞向多細胞生命演變的理想模式微生物。然而，新月柄桿菌的遺傳操作面臨諸多挑戰，如操作過程繁瑣、耗時費力且效率低下，這極大地限制了對其深入研究的潛力。 近期，中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所的趙國屏院士與趙維研究員團隊攜手上海交通大學，在《Nucleic Acids Research》期刊上發表了一篇題為“A CRISPR/SpCas9M-reporting system for efficient and rapid genome editing in Caulobacter crescentus”的方法學論文。針對新月柄桿菌遺傳操作的難題，該團隊成功開發了一套基于CRISPR/SpCas9M的基因編輯報告系統，實現了對該菌株高效、快速且無痕的基因編輯。這一成果不僅為新月柄桿菌的遺傳操作提供了強大的工具支持，還為其他難以進行遺傳操作的非模式菌株提供了新的技術思路和方法學參考。 系統設計：CRISPR/SpCas9M-報告系統 研究團隊最初構建了一個基于同源重組（HR）的CRISPR/Cas系統，將源自化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的SpCas9、sgRNA以及同源臂（H-arms）克隆至攜帶pBBR1復制子的復制型質粒pBXMCS2中。為了實現無痕編輯，同源臂之間未設計抗生素抗性基因。然而，將編輯質粒電轉化至新月柄桿菌后，幾乎未獲得菌落，且存活菌株的靶位點均未發生預期編輯。這表明CRISPR/SpCas9的切割具有致死性，而新月柄桿菌細胞內的同源重組效率又相對較低。 為解決這一問題，研究團隊對編輯質粒進行了系統性分析，并圍繞三個關鍵方向進行了優化： Cas蛋白篩選與優化：研究人員篩選了來自不同物種的Cas蛋白，包括化膿性鏈球菌Cas9（SpCas9）、新兇手弗朗西斯菌Cas12a（FnCas12a）、嗜熱鏈球菌CRISPR1-Cas9（Sth1Cas9）和嗜熱鏈球菌CRISPR3-Cas9（Sth3Cas9），以評估它們在新月柄桿菌中的編輯效率。結果顯示，這些Cas蛋白均未檢測到編輯克隆。然而，當根據新月柄桿菌的密碼子偏好性優化SpCas9編碼序列（命名為SpCas9M）后，基因編輯效率提升至約15%。 調控SpCas9M表達水平：研究人員測試了兩種誘導型啟動子——香草酸誘導型啟動子（Pvan）和木糖誘導型啟動子（Pxyl），以檢測不同誘導劑濃度下的基因編輯效率。結果表明，相對較低的SpCas9M表達水平更有利于新月柄桿菌的基因組編輯，編輯效率最高可達約40%。 引入報告系統：通過分析未發生基因組編輯的克隆中的編輯質粒，研究人員發現這些克隆的SpCas9M編碼序列均存在缺失，這證實了CRISPR/SpCas9系統的致死性，并表明新月柄桿菌中存在著強烈的選擇性壓力。基于此，研究人員提出假設：通過預先識別并排除SpCas9M突變體，可有效提升基因編輯效率。為此，他們在SpCas9M的C端融合了超折疊綠色熒光蛋白（sfGFP）作為報告系統，通過熒光信號指示，在菌落PCR前篩選并排除SpCas9M異常表達的克隆。最終，總體編輯效率提升至約80%，該系統被命名為CRISPR/SpCas9M-報告系統。 應用1：基因的單敲除、雙敲除和敲入 在新月柄桿菌中，不對稱細胞分裂由一對激酶（DivJ）和磷酸酶（PleC）協同調控。DivJ與PleC在細胞兩極的差異性定位形成磷酸化梯度，進而調控子代細胞的命運決定。值得注意的是，DivJ和PleC的極性定位并非主動過程，而是通過不同腳手架蛋白介導的招募機制實現。已有研究表明，位于細胞舊極的DivJ由PopZ-SpmX腳手架蛋白復合體招募，而位于細胞新極的PleC則通過腳手架蛋白PodJ實現定位。 為在遺傳學層面驗證上述蛋白互作關系，研究人員利用CRISPR/SpCas9M-報告系統對新月柄桿菌中的spmX和podJ基因分別進行了敲除。隨后，他們將mCherry熒光標記的DivJ和PleC蛋白分別轉化至上述敲除菌株中，并利用倒置熒光顯微鏡觀察其定位情況。結果顯示：在野生型菌株中，DivJ-mCherry特異性富集于細胞舊極，而PleC-mCherry則特異性定位于細胞新極；然而，當spmX基因被敲除后，DivJ-mCherry喪失極性定位能力；類似地，敲除podJ基因后，PleC-mCherry在細胞內呈現彌散性分布。這表明腳手架蛋白SpmX和PodJ通過直接相互作用維持DivJ/PleC的極性定位。 研究人員還構建了podJ和spmX基因的雙突變菌株（ΔpodJ-ΔspmX），發現其中DivJ-mCherry與PleC-mCherry均呈現彌散分布。值得注意的是，敲除podJ不影響DivJ-mCherry的定位，敲除spmX也不影響PleC-mCherry的定位，這表明腳手架蛋白與信號蛋白間存在正交調控關系。 此外，研究人員還利用CRISPR/SpCas9M-報告系統測試了新月柄桿菌中無標記基因插入的可行性。他們選擇中性插入位點（Neutral Insertion Site, NIS）以避免基因極性效應，并通過targetFinder鑒定出一組潛在的中性插入位點，選取評分最高的NIS位點進行基因敲入實驗。當將Pcat-mcherry敲入到中性位點后，倒置熒光顯微鏡下可觀察到菌株內的mCherry紅色熒光信號，證實基因被正確插入且有效轉錄翻譯。此外，敲入菌株的生長及形態學均未發生明顯改變，表明這些插入位點不會對新月柄桿菌的適應性造成顯著影響。 應用2：在中華根瘤菌和農桿菌中應用CRISPR/SpCas9M-報告系統 作為新月柄桿菌的近緣物種，中華根瘤菌（S. meliloti）與農桿菌（A. fabrum）在現代農業生物技術中均具有重要價值。其中，苜蓿中華根瘤菌近年來還被用作天然產物發酵的細胞工廠。然而，由于缺乏有效的細胞同源重組活性，這兩種細菌均面臨高效基因編輯的難題。盡管近來已分別開發出基于CRISPR的堿基編輯器與轉座子介導的基因組編輯工具，但對于經典的基因敲除與插入仍是該領域面臨的重要技術挑戰。 為此，研究人員測試了CRISPR/SpCas9M-報告系統在農桿菌與中華根瘤菌中的編輯能力。他們選擇編碼胸苷激酶的tdk基因作為靶標，該酶通過將5-氟-2′-脫氧尿苷（5-FUdR）磷酸化為毒性類似物氟-dUMP（F-dUMP），使細胞對5-FUdR敏感。為驗證編輯菌株表型，研究人員在含200 μg/ml 5-FUdR的PYE平板上進行生長實驗。結果顯示：Δtdk菌株可在含5-FUdR的平板上存活，而野生型中華根瘤菌與農桿菌則無法生長。 綜上所述，本研究開發的CRISPR/SpCas9M-報告系統相較于現有工具展現出顯著優勢。其成功應用于中華根瘤菌與農桿菌等農業重要微生物的基因組編輯，表明該系統可進一步擴展至微生物組研究或生物制造領域相關的其他遺傳操作困難物種。此外，該系統支持快速、迭代的遺傳操作，為基因功能研究與合成通路構建提供了理想工具。未來，對CRISPR逃逸機制的深入解析將指導設計更為穩健的CRISPR/Cas工具。CRISPR/SpCas9M-報告系統的建立不僅彰顯了可靠基因組編輯平臺的重要性，更為微生物遺傳學、合成生物學及其他生物技術領域的創新發展提供了堅實基礎。 本研究由中國科學院深圳先進技術研究院研究員趙維、上海交通大學教授艾連中擔任共同通訊作者，中國科學院深圳先進技術研究院助理研究員孫敬賢、研究助理余昕為共同第一作者。研究得到了中國科學院院士趙國屏、中國科學院深圳先進技術研究院研究員戴磊和山東大學教授王海龍的大力支持，并獲得了國家重點研發計劃、中國科學院戰略性先導科技專項、國家自然科學基金、廣東省基礎與應用基礎研究基金以及深圳合成生物學創新研究院科研計劃等多個項目的資助。 文章上線截圖 ? 圖1. CRISPR/SpCas9M-報告系統的作用原理 ? 圖2. CRISPR/SpCas9M-報告系統的搭建過程 ? 圖3. DivJ-mCherry和PleC-mCherry分別在單敲除突變體ΔpodJ和ΔspmX中的分布 ? 圖4. DivJ-mCherry和PleC-mCherry在雙敲除突變體ΔpodJ-ΔspmX中的分布 ? 圖5. 在NIS位點敲入Pcat-mcherry后的表型鑒定 ? ? 圖6.?tdk敲除突變體的鑒定